非成像式流式细胞仪的发展与应用

　　2.3  分析和分选速度的提高

流式细胞仪非常重要的一个特点就是它能够实现高速的细胞定量分析和目标细胞的分选。随着液流控制系统性能的改进和光电检测元件响应速度和计算机软件系统的不断发展进步，流式细胞仪的分析和分选速度都有质的提高。目前，BD 公司出品的 FACSAria 流式细胞分选仪获取速度可达 70000 个细胞 /s，分析速度可达 50000 个细胞 /s。这对于要通过对大量细胞的分析，建立不同细胞类型的数据库具有十分重要的现实意义，如根据细胞形态变化和内部结构的变化对肿瘤细胞进行分类等。

　　2.4  实现多色分析

流式细胞仪另一个非常重要的特点就是它能够实现对细胞的多参数测量。通过使用多种荧光标记物对细胞进行标记，测量激光激发多色荧光信号，实现单次实验对细胞多种成分测量。然而，实际中荧光标记物的发射光谱多较宽，不同的标记物标记细胞后，光电检测器检测到的荧光信号往往有重叠的现象，这就需要对荧光信号进行补偿。目前 BD 公司研发的细胞多色分析技术居于领先地位，它采用多根激光束同时激发流动室中的一个细胞，激发出来的荧光信号分别经过系统中的多个光学滤光片，被不同的光电检测器检测，这样就可以解决荧光信号重叠的问题，使多色分析达到最佳效果。BD 产品最多可进行15 色荧光分析和前向、侧向散射光分析，这样单次实验就可以同时获得多达17个参数，提供丰富的细胞信息。

　　2.5 仪器小型化 

　　低功耗、小型化、便携式的细胞分析分选仪器，一直都是各大厂商和科研院所的研究方向。随着激光光源、光电检测器件、电子计算机等相关领域的发展，器件的性能更加优越，体积也更小，这使得流式细胞仪的小型化取得很大进展。目前市场上的 C6 流式细胞仪的体积比小型微波炉还要小，重量不足 14kg，功耗也不超过 70W，是真正意义上的小型化分析仪器。

　　以 MEMS 技术（微机电系统）为基础的微流控芯片（microfluidic chip） 技术具有体积小、效率高、集成度高、速度快等特点，为生化分析领域开辟新的研究方向。国外课题组在这方面已经做很多研究。Hirono 等人采用LED 作光源的微芯片流式细胞成像分析系统实现对血小板凝集数量的计数。Wolff 课题组研制一种微芯片细胞分选器，他们将激光光源、检测器件和细胞的培养室统统集成到一个微型芯片上。该细胞分选器具有尺寸小、分选效率高、价格低等特点，同时采用封闭体系可以有效防止污染，满足环保要求。国内方面也有很多课题组从事这方面研究。姚波等人采用静电力的方法实现对细胞的筛选。当细胞经过检测区后，在芯片出样管道的分支处被施加不同电压，带电荷细胞进入出样管道后，在静电场力作用下，发生不同方向的偏转，进入到相应的收集管里，同时， 为有效消除电渗流影响， 他们还对管壁做涂层处理。

　　2.6  仪器自动化

　　以往流式细胞仪的使用都比较繁琐，使用起来有相当的难度。随着计算机技术、自动控制技术发展，目前流式细胞仪在进样、液流控制、多色荧光分析、细胞分选和数据处理等方面都已经实现自动化。例如 BD 公司的FACSAria 细胞分选仪配备液流自动控制系统和软件自动清洗程序，实现进样仓自动加压、自动混匀样本、自动冲洗进样管路、液滴监控、自动检查堵塞。系统软件的分选设定和检测功能大大简化操作， 实现细胞分选的无人操作。

　　3  流式细胞仪的应用

　　随着各种新型的荧光染料和单克隆抗体技术的发展应用，流式细胞仪在生物学和医学领域的应用范围得到进一步的扩展。目前，基本上能进行荧光分子标记的细胞或者亚细胞微粒都能被流式细胞仪检测，下面简要介绍流式细胞仪在细胞生物学、免疫学、肿瘤学等部分领域的应用。

　　3.1  在细胞生物学的应用

　　细胞内 DNA 的含量在整个细胞周期内随时都发生周期性的变化，通过荧光探针对细胞内 DNA 含量进行测量，能够有效分析各个时相的细胞百分比以及 DNA 异倍体。相对于传统染色体核型分析，流式细胞仪不仅能够实现染色体分析还能进行纯化，以获得克隆实验所需的染色体。同时， 流式细胞仪因其具有高效分析和分选能力，在分子遗传学中也有大量应用，主要是用于研究分离的染色体，以及对特定的染色体进行分选。流式细胞仪在微生物领域的应用相对较晚，但它快速、多参数测量的特点十分适合解决微生物学面临的一些问题。目前，在工业上流式细胞仪能够用于微生物的快速鉴定，例如对自来水中的微生物学鉴定和控制、对生乳中细菌总数的检测等。

　　流式细胞仪在临床医学中最早应用于肿瘤学，主要是通过 DNA 含量和线粒体数量检测进行癌前病变和早期癌症的诊断以及化疗指导和愈后评估等。流式细胞仪能够精确检测细胞内 DNA 含量，可对癌症的性质和发展趋势进行判断，利于早期诊断。实际应用中需要将实体瘤组织解聚、分散制成单细胞悬液，并用荧光染料（碘化吡啶PI）染色，对细胞内的 DNA 含量进行检测。同时需要将不易区分的群体细胞分成 G1 期、S 期和 G2 期 3 个细胞亚群，DNA 的含量直接代表细胞的倍体状态，肿瘤的恶性程度和非倍体细胞有密切关系。流式细胞仪还可对恶性肿瘤 DNA 倍体异质体进行检测，对患者临床分期、病理分级、肿瘤转移具有重要意义。肿瘤早期诊断的一个重要依据就是 DNA 非整倍体细胞峰的存在。同时，细胞的 DNA 倍体分析也能够用于病人愈后情况的早期判断。异倍体肿瘤恶变的复发率和死亡率都比较高，然而，二倍体和近二倍体肿瘤的愈后状况明显比较好。流式细胞仪除能对癌症 DNA 含量进行分析外，还能够根据癌症 DNA 的分布直方图变化情况对化疗效果进行评估，这对于癌症的化疗具有重要的指导意义。

　　3.3  在免疫学中的应用

　　随着单克隆抗体技术、荧光色素技术的发展，流式细胞仪以其快速、定量测量的特点，被广泛应用于免疫理论研究和临床实践当中。通过与荧光抗原抗体结合，对细胞表面和细胞内部的抗原、癌细胞基因蛋白定量分析，实现细胞分类和亚群分析，这对于各种血液病、癌症、B细胞淋巴瘤的早期诊断和治疗以及对人体细胞免疫功能的评估都具有十分重要的现实意义。通过对患者淋巴细胞各个亚群数量的检测可以了解淋巴细胞的分化功能，同时，通过对疾病的特异性淋巴细胞亚群或者细胞表面标记物的存在、缺失和过度表达等的研究，可以对一些免疫性疾病、 感染性疾病和肿瘤等进行早期诊断和治疗。 此外，还可以利用流式细胞仪进行组织相容性抗原群体分析和器官移植和移植后免疫状态监测。

　　3.4 在血液学中的应用

　　临床中通过对外周血 T 淋巴细胞 、骨髓细胞表面抗原和细胞内DNA 含量的检测，可以对包括白血病、淋巴瘤等多种血液病进行早期诊断、及时治疗和愈后情况的判断。由于各类血细胞都具有特异的抗原，流式细胞仪通过采用特异的抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，结合荧光染料，就可以测定某个细胞的多项参数，准确地判断细胞属性。流式细胞仪能够在患者恢复期检测体内是否还有残留的病变细胞，这对于及早发现并采取有效措施防止白血病等疾病的复发具有极其重要的现实意义。上述应用只是流式细胞仪广泛应用的一个缩影，流式细胞仪在细胞凋亡检测、器官移植、精子性别控制、临床细菌学、植物学等诸多领域都有十分广泛的应用。可以预见，随着激光、探测器、计算机技术等相关技术的发展，流式细胞仪也将会有更加广泛的应用前景。