2020 年，Moderna 和 BioNTech 开发的 mRNA 疫苗在不到一年的时间内相继获 FDA 批准有条件上市，这让底层技术 mRNA 技术备受关注，并在全球范围掀起一股创新技术热潮。
2021 年 2 月，全球首家 “环状 RNA” 初创 Orna Therapeutics 获 8000 万美元融资并正式走出隐匿模式，这也预示着 “mRNA2.0” 时代的来临。理论上，与线性 RNA 相比，这种环状 RNA——oRNA 呈封闭环状的结构，不易降解，可更高效稳定地表达蛋白质。
与此同时，越来越多的 mRNA（自扩增 / 非复制）技术、环状 RNA 等初创如雨后春笋般涌现，不断推陈出新，斩获大额融资。
2021 年 5 月，环状 RNA 公司 Laronde 带着 4000 万美元正式出道，时隔 3 个月后，该公司再次斩获 4.4 亿美元融资。无独有偶，Laronde 与 Moderna 同为 “资本的宠儿”，还师出同门，均由美国知名风险机构 Flagship Pioneering（以下简称 “FP”）孵化。
该公司把其正在研究的环状 RNA 称之为 Endless RNA™（eRNA），并宣称 eRNA 具有持久性、非免疫原性、允许重复给****、灵活的配制和递送方式等优势。理论上，这种 RNA 能够在体内长期存在，并表达用于治疗疾病的蛋白质。
今年 6 月，国内环状 RNA 公司环码生物正式成立并斩获千万美元天使轮融资；国内环状 RNA 产研服务商吉赛生物也在从服务转向基于具有重大功能的环状 RNA 翻译产物开发疾病治疗靶点。
与线性 mRNA 相比，环状 RNA 的优势是什么？整体研发现状如何？真正释放产业化潜力还有哪些难题有待解决？
1976 年，德国科学家 Heinzl. Sanger 等人在PANS发表文章，证实了类病毒（Viroids）是一种单链共价闭合环状 RNA 分子，这是人类首次发现环状 RNA 分子的存在。但在当时的背景下，科学家们只将其看作一种冗余的错误剪接产物。
2012 年，斯坦福大学的生物医学和生物化学副教授 Julia Salzman 发现人体中大量存在一类环状 RNA 暗物质，被誉为 "改写教科书的重****现"。
2013 年，Nature报道了两篇文章，首次在功能上表征天然环状 RNA 分子；2014 年，在拟南芥中也确认了 circRNA 的存在，由此拉开植物 circRNA 的研究序幕。自此，大量科学家开始涌入这个领域。
同一时期，在国外，美国 RNA 技术开发公司 Arraystar 推出全球首款商业化的环状 RNA 芯片；在国内，中科院生物物理研究所的范祖森教授课题组研究了小鼠骨髓细胞中分离的长期造血干细胞和多能干细胞的环状 RNA 的表达谱，曹雪涛院士课题组研究了环状 RNA 在肝癌中发挥的功能。
大多数真核基因以内含子和外显子间隔排列，转录本通常需要通过可变剪接去掉内含子，这种机制可以从特定的基因中产生多种 mRNA 分子。在人类基因组中，95 % 以上的基因是具有可变剪接的，它们通常由顺式调节元件和反式作用因子共同调控。这其中，除了产生各种线性 mRNA 之外，许多真核基因也产生出具有末端共价连接的环状 RNA。即下游剪接位点与上游剪接位点连接形成的闭合环状分子。
其次，外显子跳读所形成的套索驱动环化也是环状 RNA 生成的一种机制；此外，剪接过程中从分支结构脱离的内含子索套也会产生环状 RNA。
长期以来，环状 RNA 一直被认为是 mRNA 剪切过程中的副产物，没有特定的功能。但近年来，人们在真菌、原生生物、植物、果蝇、小鼠以及人类细胞中相继发现很多环状 RNA。越来越多的研究表明，环状 RNA 并非 mRNA 剪切的副产物，而是在细胞中发挥重要作用的一类 RNA 分子。
这种 RNA 相当于线性 RNA 分子中的 3’ 和 5’ 端被连接形成了闭合环状结构，失去了 PolyA 尾巴，因此对核酸外切酶不敏感，也可以更加稳定地存在。
香港城市大学生物医学系助理教授史家海表示，“环状 RNA 的优势主要在于可以防止降解，提高 RNA 的表达时间和表达量，因为 RNA 的降解是从尾端开始，环化后就没有酶切的尾端了，只有 RNA 核酸内切酶才能切，所以环状 RNA 比线性 RNA 在血浆中的表达时间更长，预计在细胞中也是更长。” 史家海在 3 年前就开始了环状 RNA 的相关研究。
在 FP 推出环状 RNA 公司 Laronde 之际，其首席执行官 Diego Miralles 就曾表示，除了可以在体内长效稳定表达之外，环状 RNA ****物还可以重复给****，并且可以通过多种途径向患者给****，包括皮下、静脉、肌内和外用的方式。
与线性 mRNA 相比，环状 RNA 是闭合的环状结构，不能利用真核细胞的翻译机制，需要依赖一些翻译启动元件的参与启动翻译。目前已经发现的环状 RNA 的翻译方式主要有核糖体介入位点 (internal ribosome entry site，IRES) 介导的翻译、滚环扩增翻译、由 UTR (untranslated region) 翻译激活元件介导的翻译和 m6 A 修饰介导的翻译 。
"目前主流的是 IRES，因为这个元件能够被核糖体识别，比较独特，很多做环状 RNA 的公司都会选择这种方式"，吉赛生物的 CEO 刘明告诉生辉，"滚环翻译的方式能够让环状 RNA 翻译产生不同大小的蛋白质，也可以利用有限的核苷酸序列翻译出更大的蛋白质，这是 mRNA 无法做到的事情，在产业化上更有想象空间。" 吉赛生物是在环状 RNA 赛道蛰伏 7 年的产研服务商，正在布局产业化赛道。
上海环码基因的联合创始人王泽峰也在接受媒体采访时表示，只要 mRNA 可以干的事情，环状 RNA 都可以干，但是环状 RNA 又能干一些 mRNA 干不了的事情。
Laronde 的首席执行官 Diego Miralles 就表示，其环状 RNA 平台能够在体内表达任何治疗性蛋白质，包括肽、凝血因子等，任何类型的治疗性抗体，包括跨膜蛋白、疫苗等，甚至是生物学上从未做过的事情，例如细胞内抗体或离子通道。并且宣称团队已经证明其环状 RNA 可以在动物体内获得稳定、持久的蛋白质生产。
自 1976 年发现环状 RNA 分子以来，学术界开启了对环状 RNA 的漫漫探索之旅。2013 年，学术界在环状 RNA 领域取得重大进展，越来越多的科学家们进入了该领域。
基础研究兴起的同时，产业转化的潜力也已初现。整体来看，产业化发展的方向又可以大体分为科研服务（测序分析、构建）、IVD、CXO、****物研发等几类，其中****物研发也被视为极具潜力的细分领域。“个人认为，对标 mRNA，环状 RNA 拥有无可比拟的优势，基因治疗和新****开发将是其最具价值的方向。” 刘明说。
国外基于环状 RNA 的测序公司包括 Arraystar、IntegrateRNA、CD Microarray、 Cofactor Genomics 等，其中 Arraystar 公司曾推出全球首款商业化的环状 RNA 芯片。
根据不完全资料统计，目前国内涉及环状 RNA 相关方向的公司，90% 的公司以上融资规模较小，近 70% 的公司主要业务以科研服务为主，近 30% 的公司以环状 RNA 为标志物来检测疾病，布局 CXO 服务的有锐博生物、吉赛生物。
在****物研发领域，全球整体产业化进展较慢，其中美国环状 RNA 进展最快，今年上半年走出两家初创公司 Orna Therapeutics 和 Laronde，且融资金额屡创新高。这两家环状 RNA 公司均由知名 VC 孵化而来，含着 “金汤匙” 出生；国内在环状 RNA ****物研发领域与美国相差不大，但环状 RNA ****物研发公司整体披露的信息比较少，现已披露的公司有 2010 年成立的吉赛生物，2021 年成立的环码生物，融资规模比较小。
公开资料显示，半年内全球环状 RNA 领域累计获得超 6 亿融资，美国两家公司独占 5.7 亿美元，国内环码生物斩获千万美元融资，吉赛生物暂未融资。
Orna Therapeutics 带着 8000 万美元亮相之际，背后站着知名 VC 和 BMS、Kite、诺华生物医学研究所等制****大厂。该公司的创始团队为 Alex Wesselhoeft 和 Dan Anderson 领衔的 MIT 团队，他们在 2018 年、2019 年取得一系列进展，相关成果也发布在《自然》和《细胞》上。作为全球首家环状 RNA ****物研发公司，该公司将其开发的环状 RNA 称之为 oRNA，他们认为 oRNA 相当于 mRNA2.0 版，在生产、递送和治疗效果方面更具有优势。
3 个月后，Laronde 也正式亮相，他们将其开发的环状 RNA 称之为 “eRNA”，Laronde 的目标是在未来 10 年内生产 100 种基于 eRNA 的****物。
同年，国内环状 RNA 初创公司环码生物成立，并于今年 6 月完成了千万美元天使轮融资。该公司由中科院营养与健康研究所教授、中科院计算生物学重点实验室主任、RNA 系统生物学课题组组长王泽峰教授创办。他在环状 RNA 调控机制和工程化应用方面具备一定研究成果和技术积淀；中科院上海营养与健康研究所副研究员杨赟博士是环码生物的共同创始人兼 CTO，他在 RNA 体外环化和环状 RNA 翻译效率调控等方面同样具有多年基础研究和技术开发经验。
吉赛生物则是一家成立 11 年之久的环状 RNA 产研服务公司，同时也是国内最早布局环状 RNA 的公司。该公司最初以提供环状 RNA 基因治疗的 CRO 和 CDMO 服务起家，主要聚焦环状 RNA 核心技术和完备的环状 RNA 研究体系。今年 8 月，刘明在接受媒体采访时透露除了环状 RNA CRO 服务以外，吉赛生物还将基于前期发现具有重大功能的环状 RNA 翻译产物开发疾病治疗靶点。
“总体来看，无论是线性 RNA 还是环状 RNA 都才刚刚起步，上游技术和科研成果的储备尤其重要。如果新冠疫情还未得到很好控制，而且环状 RNA 疫苗比目前疫苗的免疫效果更好，环状 RNA 可能会得到很好很快的应用。” 刘明说。
尽管环状 RNA 优势明显，产业化潜力巨大，但也有诸多问题需要解决。
史家海告诉生辉，环状 RNA 目前面临的首要问题是环化效率低；其次，环状 RNA 没有 5‘端的帽子结构，所以需要内部核糖体进入位点作为启动区域，但是内部核糖体进入位点的效率没有帽子的效率高。史家海表示正在开发 RNA 复制酶以解决 RNA 连接缺口不平的问题。
在过去几年间，环码基因王泽峰实验室也一直专注于环形 RNA 的翻译效率上。此外，该实验室也在深入研究 AI，以便通过序列设计来提高相关性能。
至于其在未来应用上是否会超越线性 RNA，史家海直言，“如果是需要提高表达量的应用，环状 RNA 效果会更好。”
在产业转化上，精准快速的环状 RNA 制备仍然是技术难题。刘明告诉生辉，“目前环状 RNA 制备的主流技术主要是体外转录后自剪切形成环状 RNA。此方法制备的环化 RNA 也会参入无关序列，影响环状 RNA 天然结构和独特功能；另外使用连接酶进行 RNA 的环化连接，会产生相当多的聚合副产物，实际合成以及后续的产物纯化回收过程较复杂，导致制备效率低，不利于产业化。另外，规模化量产也是产业化的难题之一。”
需要注意的是，今年 7 月，Cell Reports在线发表了上海交通大学 Bio-X 研究院 PI 胥川博士和美国密西根大学张建之教授关于哺乳动物环状 RNA 的研究。
该研究给出了一系列证据表明环状 RNA 大部分源自于剪接错误，并估算出超过 97% 环状 RNA 是无用甚至有害的，他们认为绝大多数环状 RNA 是垃圾 RNA。但这与少数环状 RNA 被证实具有功能的事实并不矛盾。
参考资料：
http://news.sciencenet.cn/htmlpaper/2021/8/202182016253068065868.shtm
https://www.researchgate.net/publication/332677132_The_emerging_roles_and_functions_of_circular_RNAs_and_their_generation
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(21)00856-1?_returnURL=https%3A%2F%2Flinkinghub.elsevier.com%2Fretrieve%2Fpii%2FS2211124721008561%3Fshowall%3Dtrue
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