利用RRLC改善西洋参HPLC的分离速度和灵敏度
概述
西洋参(又名花旗参)系五加科植物西洋参(Panax quinquofolimm L.)的干燥根,西洋参的根部及地上茎叶部分含有多种生理活性成分,其中主要是西洋参皂甙和三萜类化合物,三萜类化合物与人参皂甙结构相似。西洋参皂甙是西洋参中主要的有效成分,也是生理活性最显著的物质。其中人参皂苷的Rb1又是西洋参主要特征成分,其含量高于人参,也是西洋参与人参鉴定的主要依据。
在2005版中国药典一部中,西洋参活性成分的含量测定采用了以十八烷基键合硅胶为填料、以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱的液相色谱分析方法。该方法主要需要分离人参皂苷Rg1、Re与Rb1,因3个化合物结构相似,尤其是Rg1和Re(见图1),故HPLC需要利用长时间的浅梯度分离。3个色谱峰的HPLC分离时间需要约60min,分离一次的运行时间长达120min。本研究是在中国药典HPLC梯度方法的基础上,选择合适的键合相填料,开发以小颗粒填料技术为基础的RRLC方法,在满足分离度要求的前提下,实现快速、灵敏、可重现的方法学目标。
图1 人参皂苷的结构
RRLC方法转换和优化
快速高分离度液相色谱(RRLC, Rapid Resolution Liquid Chromatography)利用亚二微米小颗粒填料分离的液相色谱技术,与常规较大颗粒(如5mm)不同,小颗粒可以显著改善液相色谱的分离度、分离速度和灵敏度。因RRLC分离常常使用与HPLC不同的仪器和色谱柱,故在RRLC分离时需要对原始HPLC分离条件进行适当的调整或优化。
色谱柱的选择
因流动相中含有磷酸,RRLC分析采用内含1.8小颗粒的ZORBAX StableBond C18色谱柱。该填料在低pH条件下具有杰出的稳定性,是低pH条件液相色谱分离的首选。色谱柱规格选择了4.6×50mm的RRHT色谱柱,其柱长与粒径之比(L/dp≌28)与规格为4.6×150 mm, 5的常规HPLC色谱柱相当(L/dp=30),故可以获得相近的分离效率,但分离速度大大提高,并且可以改善灵敏度。
色谱柱内径的选择主要考虑方法转换的方便性,选择与HPLC色谱柱相同内径的RRHT色谱柱可以降低方法转换的可变性。本方法采用了与HPLC色谱柱相同内径(4.6mm)的RRHT色谱柱。如选用更小内径的色谱柱,可以在保持线速度相同的前提下获得相同的分离结果,并进一步降低溶剂消耗。
方法转换的初步参数确定
在Method Translator相应栏目中输入原始HPLC条件,包括HPLC色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数,并选择RRLC色谱柱的规格,即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的RRLC分离的初步参数。
因小颗粒填料在较高的线速度下可以保持柱效(分离度),故可以通过提高流速的方式进一步提高分离速度。如需保持分离度相同,则在流速调整时要保持流速与梯度时间乘积不变,即提高流速的同时等比缩短梯度时间。本研究根据中国药典一部中给定的西洋参梯度分离条件和上述原则,确定了初始实验条件。
方法优化
起始试验条件虽然获得了与药典原始HPLC方法相似的RRLC分离谱图,但因色谱柱选择性的差异等影响,并没能基线分离结构相近的目标化合物Rg1与Re。因此,方法需要进行进一步摸索与优化。适当降低流动相在Rg1与Re出峰附近的洗脱强度,两色谱峰的分离度获得了初步改善,但仍未实现基线分离。考虑到温度对分离选择性的可能影响,尝试设置不同柱温考察分离选择性的变化。原始中国药典的方法所用柱温为40℃,本实验在原始条件的基础上,又分别在25℃和30℃下进行了分离(见图2)。
图2 不同温度下,Rg1与Re的分离度比较
图3 西洋参中人参皂苷的RRLC分离结果
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